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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’animal à la chirurgie
- Effectuez les interventions chirurgicales dans un espace propre et dédié. Autoclavez tous les instruments chirurgicaux et stérilisez-les avec un stérilisateur à billes de verre avant l’opération.
REMARQUE : Dans ce protocole, utilisez des souris FVB postnatales du 10e au 12e jour (P10-12). Différents âges et souches de souris peuvent être utilisés pour répondre aux besoins d’un projet spécifique. Les souris plus âgées que P40 peuvent être difficiles car l’os de la bulle devient plus dur. - Anesthésiez les souris avec une injection intrapéritonéale d’un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg), de chlorhydrate de xylazine (10 mg / kg) et d’acépromazine (2 mg / kg). Ne commencez la préparation chirurgicale qu’après que l’animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que le pincement des orteils. Si nécessaire, administrez une dose de rappel (un cinquième de la dose initiale) du cocktail anesthésique pour rétablir le plan anesthésique d’origine.
REMARQUE : Soyez prudent à cette étape car la plupart des décès observés à cet âge sont causés par un surdosage d’anesthésique. - Couvrez les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique protectrice pour garder les yeux humides pendant l’anesthésie, supprimant ainsi le réflexe de clignement de l’animal.
- Pour prévenir l’hypothermie post-anesthésie, positionnez la souris avec son cou étendu sur un coussin chauffant tout au long de la procédure jusqu’à ce qu’elle soit totalement réveillée.
- Rasez la région post-auriculaire gauche avec une tondeuse et désinfectez avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée avant la manipulation chirurgicale.
2. L’intervention chirurgicale et l’injection de vecteur
- Utilisez une approche post-auriculaire pour exposer la bulle tympanique. Inciser le tissu sous-cutané avec de petits ciseaux pour exposer le muscle post-auriculaire. Après avoir rétracté le tissu adipeux vers la face postérieure de l’incision, séparez les muscles des côtés droit et gauche perpendiculairement à l’incision pour exposer l’os temporal. Assurez-vous que cette incision est suffisamment longue pour fonctionner confortablement avec une visualisation adéquate.
- Perforez la bulle tympanique avec une aiguille de 25 G et élargissez le trou si nécessaire avec une pince en retirant l’os pour permettre l’accès à la rotation basale de la cochlée, puis élargissez-le suffisamment pour visualiser l’artère stapédienne et la membrane de fenêtre ronde (RWM).
- Percez doucement le RWM au centre à l’aide d’une pipette capillaire en borosilicate. Observez l’efflux de fluide à travers le RWM à ce point ; C’est normal. Attendez que l’efflux se soit stabilisé (le liquide écoulé de la cochlée est séché avec un papier filtre stérile).
REMARQUE : Faites attention lorsque vous tenez et avancez l’aiguille de verre de manière à ce que la perforation RWM soit aussi petite que possible. Selon le microscope utilisé, tenez les pipettes à l’aide d’un micromanipulateur ou à la main à l’aide d’un porte-pipette. - Préparez les pipettes pour l’injection à l’aide d’un extracteur de pipettes, de la même manière que les pipettes à pince patch sont préparées. Assurez-vous que le diamètre de la pointe est grand (environ 15 μm de diamètre) afin que le pipetage du virus se fasse facilement.
- Prélevez 1 à 2 μl de virus adéno-associés (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP) dans une pipette d’injection. Une fois l’efflux stabilisé (5 à 10 min), microinjectez ce volume fixe dans la rampe tympanique par le même trou précédemment réalisé en RWM.